FastKing Otu Nzọụkwụ RT-PCR Kit

A -1 RNA na-emebi emebi

——Sachapụ RNA dị elu nke na -enweghị mmetọ. Ihe sitere na ya wepụta RNA kwesịrị ịdị ọhụrụ ka enwere ike igbochi mbibi RNA. Nyochaa iguzosi ike n'ezi ihe RNA na gel ekwesighi tupu mmeghachi omume RT. Mgbe mwepụsịrị RNA, ekwesịrị ịchekwa ya n'ụdị formamide 100%. Ọ bụrụ na ejiri ihe mgbochi RNase, ọnọdụ ikpo ọkụ kwesịrị ịdị <45 ° C, na pH kwesịrị erughị 8.0, ma ọ bụghị ya, onye na -egbochi ya ga -ahapụ RNase agbụ niile. Ọzọkwa, ekwesịrị ịgbakwunye ihe mgbochi RNase na ngwọta nwere T 0.8 mM DTT.

A-2 RNA nwere ndị na-egbochi mmeghachi omume ntụgharị

——Ndị na -egbochi ntụgharị ihu gụnyere SDS, EDTA, glycerol, sodium pyrophosphate, spermidine, formamide, nnu guanidine, wdg. Gwakọta RNA njikwa na ihe nlele, ma tulee mkpụrụ ya na mmeghachi omume RNA njikwa iji lelee ma enwere onye na -egbochi ya. Jiri mmiri etinyere 70% (v/v) sachaa mmiri ozuzo RNA iji wepu ihe mgbochi.

A.

——Kpebisie ike na ọnọdụ ikpuchi ọkụ kwesịrị ekwesị maka isi ihe eji eme nnwale ahụ. Maka hexamers na -enweghị usoro, a na -atụ aro idobe ọnọdụ okpomọkụ na 25 Celsius C maka nkeji 10 tupu iru ogo mmeghachi omume. Maka akara mkpụrụ ndụ ihe nketa (GSP), nwalee GSP ndị ọzọ, ma ọ bụ gbanwee gaa na oligo (dT) ma ọ bụ hexamer random.

A-4 Obere ego ịmalite RNA

—— Mee ka ọnụ ọgụgụ RNA mụbaa. Maka nlele RNA erughị 50 ng, enwere ike iji 0.1 μg ruo 0.5 μg acetyl BSA na njikọ cDNA nke mbụ.

A-5 egosighi usoro ebumnobi na anụ ahụ nyochara.

—— Nwalee anụ ahụ ndị ọzọ.

Mmeghachi omume A-6 PCR ada ada

—— Maka usoro RT-PCR nke nwere nrịgo abụọ, ndebiri cDNA dị na PCR agaghị agafe 1/5 nke olu mmeghachi omume.

A-1 Mgbakwunye nkenke nke ndebiri na ndebiri

—— ngwụcha 3'-njedebe ekwesịghị ịnwe 2-3 dG ma ọ bụ dC. Jiri ihe nrịbama akọwapụtara Gene na njikọ eriri mbụ kama iji akara ma ọ bụ oligo (dT). Jiri oke ọkụ annealing dị elu n'ime usoro okirikiri ole na ole mbụ, wee jiri obere okpomọkụ annealing. Jiri polymerase Taq DNA na-amalite ọkụ maka PCR iji melite nkọwa nke mmeghachi omume.

A-2 ụdị adịghị mma nke mkpụrụ ndụ ihe nketa

—— Soro otu ụkpụrụ maka imepụta mbido mbido.

A-3 RNA merụrụ na DNA genomic

——Gaa RNA na DNase-PCR ọkwa PC. Hazie mmeghachi omume nchịkwa na-enweghị ntụgharị ntụgharị iji chọpụta mmetọ DNA.

A-4 Na-akpụpụta dimer primer

——Mepụta ihe nrụpụta na -enweghị usoro mgbakwunye na njedebe 3 '.

A-5 Mg dị elu²⁺ ịta

——Bụlite Mg²⁺ ịta maka ndebiri ọ bụla na njikọta mbido

A-6 merụrụ ahụ na DNA mba ọzọ

—— Jiri ndụmọdụ na-eguzogide ikuku na-emegide ikuku na enzymes UDG.

A-1 Ọdịnaya nke ngwaahịa eriri akpa nke a dị oke elu

—— Belata ọnụego ngwaahịa eriri mbụ na usoro mmeghachi omume PCR nkịtị.

A-2 buru oke ego mbido na mmeghachi omume PCR

——Bụlata ntinye mbido.

A-3 Ọtụtụ okirikiri

—— Mee ka ọnọdụ mmeghachi omume PCR dị elu ma belata ọnụọgụ okirikiri PCR.

A-4 Ọkụ ọkụ annealing dị oke ala

——Mụba okpomoku ọkụ iji gbochie mmalite na ndọtị na-abụghị nke akọwapụtara.

A-5 Nkọwapụtabeghị nke ọma iberibe oligonucleotide nke DNase na-emebi DNA —— Wepụ RNA dị elu iji gbochie mmetọ DNA.

RT-PCR ga-atụgharị idegharị RNA ka ọ bụrụ cDNA, wee jiri cDNA edegharịrị edegharị dị ka ndebiri maka mmeghachi omume PCR iji bulie iberibe ebumnuche ahụ. Họrọ ma ọ bụ primers na -enweghị usoro, Oligo dT na mkpụrụ ndụ ihe nketa akọwapụtara dịka ọnọdụ nnwale ahụ siri dị. Enwere ike iji primers niile dị n'elu maka obere eukaryotic cell mRNA na -enweghị usoro ntutu isi.

Random primer: Kwesịrị ekwesị maka ogologo RNA nwere usoro ntutu isi, yana ụdị RNA niile dị ka rRNA, mRNA, tRNA, wdg A na-ejikarị ha eme ihe maka mmeghachi omume RT-PCR nke otu ndebiri.

Oligo dT: Kwesịrị ekwesị maka RNA nwere ọdụ PolyA (RNA prokaryotic, eukaryotic Oligo dT rRNA na tRNA enweghị ọdụ PolyA). N'ihi na Oligo dT na-ejikọ n'ọdụ ọdụ PolyA, a chọrọ ogo nlele nke RNA ka ọ dị elu, ọbụlagodi ntakịrị mbibi ga-ebelata oke njikọ cDNA zuru oke.

Ihe mbido mkpụrụ ndụ ihe nketa: Mmeju na usoro ndebiri, dabara maka ọnọdụ ebe amaara usoro ebumnuche.

Enwere ụzọ abụọ:

1. Usoro ntụnyere n'ime: Na tiori, cDNA bụ iberibe DNA nke ogologo dị iche iche, yabụ nsonaazụ electrophoresis bụ teme. Ọ bụrụ na ụba RNA dị ala, ọ nweghị ngwaahịa ga -egosi na electrophoresis, mana nke a apụtaghị na PCR agaghị abawanye ngwaahịa. Na mkpokọta, enwere ike iji ntụaka nke ime chọpụta cDNA. Ọ bụrụ na ntụnyere dị n'ime nwere nsonaazụ, enwere ike ekwe nkwa ịdị mma nke cDNA (n'ọnọdụ ole na ole, ọ bụrụ na iberibe mkpụrụedemede lekwasịrị anya dị ogologo, enwere ike ịnwe ihe ndị ọzọ).

2. Ọ bụrụ na enwere mkpụrụ ndụ ihe ama ama nke ndebiri a na -abawanye, ndị mbido nke mkpụrụ ndụ ihe nketa a nwere ike nyochaa ya. Mgbakwunye nke akwụkwọ ntinye aka apụtaghị na enweghị nsogbu na cDNA. N'ihi na ntụnyere n'ime nwere nnukwu cDNA, ọ dị mfe ịgbasa. Ọ bụrụ na cDNA emebila akụkụ ya ụfọdụ maka ebumnuche dị iche iche, site n'echiche nke puru omume, nsonaazụ PCR nke obere mkpụrụ ndụ ihe nketa lekwasịrị anya ga -emetụta nke ukwuu. Ọ bụ ezie na nrụtụ aka n'ime ka bara ụba nke ukwuu, ikekwe mmetuta agaghị emetụta ya.

Akụkụ ụfọdụ na -eweda RNA ala. Chọpụta iguzosi ike n'ezi ihe na ịdị ọcha nke RNA

Ihe dị n'ime RNA nke ụdị dị iche iche nwere ike ịdị iche, mana n'ozuzu, mkpokọta RNA ewepụtara kwesịrị ịnwe eriri 28S na 18S doro anya na gel electrophoresis, na nchapụta nke ndị otu mbụ kwesịrị ịdị elu karịa nke ikpeazụ. Otu 5S na -egosi na RNA emebiela, nchapụta ya dabara na ogo mbibi ya. Ịbawanye nke ọma n'ịtụgharị aka n'ime ya apụtaghị na RNA enweghị nsogbu, n'ihi na ntụnyere n'ime nwere ụba nke ukwuu, enwere ike ịbawanye RNA ma ọ bụrụhaala na mbibi ahụ adịghị njọ. Ihe OD₂₆₀/OD₂₈₀oke nke RNA dị ọcha nke ejiri spectrophotometer tụọ kwesịrị ịdị n'agbata 1.9 na 2.1. Ntakịrị adịghị ọcha protein na RNA ga -ebelata oke. Ọ bụrụhaala na uru ahụ adịchaghị ala, RT agaghị emetụta ya. Ihe kacha mkpa maka RT bụ iguzosi ike n'ezi ihe RNA.

Mgbakwunye nke mkpụrụedemede nrụnye n'ime nwere ike igosi na RT emeela nke ọma, mana ọ baghị mkpa na ogo eriri cDNA. N'ihi na iberibe akwụkwọ ntụaka dị n'ime ya pere mpe ma dị elu n'okwu, ọ na -adịrị ha mfe inwe ihe ịga nke ọma na ntụgharị ntụgharị. Otú ọ dị, nha na ngosipụta nke mkpụrụ ndụ ihe nketa na -adịgasị iche site na mkpụrụ ndụ ihe nketa gaa na nke ọzọ. Agaghị ekpe ikpe ịdị mma cDNA naanị site na ntụnye aka n'ime, ọkachasị maka iberibe ebumnuche ahụ karịrị 2 kb.

Ụfọdụ nlele nwere ihe nrụpụta nke abụọ dị mgbagwoju anya, ma ọ bụ nwee ọdịnaya GC bara ụba, ma ọ bụ dị oke ọnụ ahịa nke nwere obere ihe. N'ọnọdụ ndị a, ekwesịrị ịhọrọ transcriptase kwesịrị ekwesị dabere nha nke iberibe ebumnuche na nlele. Maka ndebiri RNA nwere ọdịnaya GC dị elu yana usoro nke abụọ dị mgbagwoju anya, ọ na -esiri ike imeghe usoro nke abụọ na obere okpomọkụ, ma ọ bụ nwee transcriptase nkịtị. Maka ndebiri ndị a, enwere ike họrọ Quant Reverse Transcriptase, ebe ọ bụ na ntụgharị ntụgharị ya dị mma karịa nke M-MLV usoro ntụgharị transcriptase, nke nwere ike tụgharịa depụta ndebiri RNA dị iche iche nke ọma wee depụta RNA n'ime eriri mbụ cDNA ruo oke. Mgbe ị na -eji ngwa transcriptase izugbe, sistemụ 20 μl nwere ike na -atụgharị ntụgharị 1 μg nke RNA zuru oke. Biko leba anya na ike RT kachasị nke ngwa. Ọ bụrụ na agbakwunyere ndebiri ahụ, ntụgharị ntụgharị ga -amasị RNA n'ụba. Ya mere, ọ ka mma ịghara ike karịa nke sistemụ.

A-1 Kpebie ma RNA emebiela nke ukwuu yana ọ bụrụ na RT na-eme nke ọma

Na mkpokọta, ihe kpatara ọdịda nkwalite nrụtụ aka n'ime ime na -abụkarị mmebi RNA dị njọ. Ihe ọzọ nwere ike ime bụ ọdịda ntụgharị ntụgharị. Enweghị ike iji ntụaka ime dị ka ọkọlọtọ iji kpebie ịdị mma otu eriri cDNA, mana enwere ike iji ya dị ka ọkọlọtọ iji kpebie ma ntụgharị ntụgharị ọ na -aga nke ọma ma ọ bụrụ na enweghị nsogbu nke ogo RNA. Ihe kacha mkpa na usoro ntụgharị ntụgharị bụ idobe ọnọdụ okpomọkụ mgbe niile yana usoro mmeghachi omume mgbe niile iji meziwanye mmeghachi omume.

A-2 Kpebisie ike ma ihe mbido maka ịbawanye mkpụrụ ndụ ihe ntụnye n'ime bụ nke a pụrụ ịtụkwasị obi yana ọ bụrụ na enwere nsogbu ọ bụla na reagents eji na PCR.

Maka ịha nhatanha, RNA ga -ahazi tupu ntụgharị ntụgharị, nke a na -achọkwa n'ọtụtụ ngwa ntụgharị ntụgharị, dịka ọmụmaatụ, tụọ ntinye RNA dị ka 1 μg. Ebe ọ bụ na cDNA nke edegharịrị edegharị bụ ngwakọta agwakọtara, gụnyere RNA, oligo dT, enzyme, dNTP, na ọbụna ntakịrị DNA fọdụrụ, a ga -enwe ndapụta, yabụ na ọ gaghị ekwe omume ịkọwapụta cDNA nke ọma. Ya mere, nhazi RNA dị mkpa. N'ịtụle arụmọrụ ntụgharị ntụgharị bụ otu n'etiti nlele dị iche iche, ego nke cDNA enwetara kwesịrị ịbụ otu, nyocha ọnụọgụ nwere ike igosi ntụnyere ọkwa ọkwa nke mkpụrụ ndụ ihe nketa dị iche iche na otu RNA niile. Mgbe ị na -eme PCR ọnụọgụ fluorescence, ọnụọgụ cDNA nwere ike ọ gaghị adị mkpa ka emezigharịrị ya n'ihi na mkpụrụedemede nrụnye n'ime nwere ike rụọ ọrụ dịka ntụaka.

Ọ na -emetụta ya na mkpụrụ ndụ ihe nketa, na ntụgharị ntụgharị nke obere ibe adịghị ekwe omume maka ọtụtụ mkpụrụ ndụ ihe nketa. Nke mbu, arụmọrụ nke ntụgharị ntụgharị dị ala karịa nke PCR. Nke abuo, mpaghara bara ụba nke GC na nhazi nke abụọ nke ọtụtụ mkpụrụ ndụ ihe nketa na -egbochi ma ntụgharị ntụgharị na PCR. N'ikpeazụ, ikwesị ntụkwasị obi na arụmọrụ nkwalite nke PCR siri ike ịkwado n'otu oge. N'ime usoro ntụgharị nke ọzọ, ọ nweghị onye nwere ike ikwe nkwa na ọ ga -enweta obere iberibe maka mkpụrụedemede dị ala, ọkachasị na -eji oligo dT. Maka 5 'UTR nwere ọtụtụ GC, ọ na -esikwu ike. Ya mere, ọ ka bụ ụzọ ezi uche iji tụgharịa transcript na primers na -enweghị usoro, chọta saịtị mkpochapu ekewa n'ime iberibe ebumnuche, gbasaa site na ngalaba, wee mee mgbaze mmachi na ligation. Na mkpokọta, ọ na -esiri ike ịgbatị iberibe ndị buru ibu karịa 2 kb, mana ọ naghị ekwe omume mgbe niile ịnweta: 1. Nke mbụ, na -ekwe nkwa iguzosi ike n'ezi ihe nke RNA/mRNA, na -ahọrọ mmịpụta TRIZOL. Enwere ike iji ngwa 2.M-MLV RT-PCR ozugbo. Gbatịa oge mgbakwunye ma mụbaa ọnụọgụ okirikiri na usoro nkwalite nke ọma. N'aka nke ọzọ, enwere ike itinye PCR akwụkwụ, ma ọ bụ buru ụzọ mee mmeghachi omume otu ma ọ bụ abụọ site na iji denaturation agbatị na oge ịgbatị tupu nkwalite PCR nkịtị, nke nwere ike inye aka ịgbatị iberibe. Lezienụ anya na ntụkwasị obi nke polymerase. Enwere ike iji Long Taq na PCR iji nweta ezigbo nsonaazụ. 4. Maka ngwa okwu protein, ekwesịrị itinye polymerase kwesịrị ntụkwasị obi.

Enwere ụdị transcriptase abụọ nke TIANGEN nyere: Quant/King RTase na TIANScript M-MLV. Isi ihe dị iche n'etiti ha bụ ntinye ntinye ndebiri. Quant bụ transcriptase pụrụ iche, nke dị iche na M-MLV a na-ejikarị enweta site na nje Moloney murine leukemia. Quant bụ transcriptase ọhụrụ gosipụtara arụmọrụ dị elu nke injinịa Escherichia coli gosipụtara. Quant dabara maka ịgbasa 50 ng-2 μg nke RNA yana ọrụ ntụgharị ntụgharị dị elu yana mkpụrụ dị elu. E jiri ya tụnyere MMLV nkịtị ma ọ bụ AMV, njirimara kacha ukwuu nke Quant bụ na ọ nwere mmekọrịta siri ike na ndebiri RNA ma nwee ike tụgharịa ndebiri ihe mgbagwoju anya na -enweghị nrụpụta oke okpomọkụ. Maka ndebiri nwere ọdịnaya GC dị elu, nrụpụta azụ dị elu. Agbanyeghị, ntụgharị ntụgharị a nwere ọrụ RNase H, nke nwere ike imetụta ogologo ngwaahịa cDNA (dabara maka ndebiri 4.5 kb). Maka ntụgharị ntụgharị ihu, TIANScript MMLV transcriptase akwadoro. RTase a bụ enzyme gbanwetụrụ yana ọrụ RNase H na -esighị ike, nke dabara maka njikọ cDNA ogologo (> 5 kb).

A na-emezigharị ntụgharị ntụgharị otu-nzọụkwụ na nkwalite PCR n'otu tube ahụ na-emepeghị mkpuchi mkpuchi n'etiti njikọ cDNA na mmụba, nke na-enyere aka belata nsị. Ebe ọ bụ na a na -eji ihe nlele cDNA niile enwetara maka mmụba, mmetụta ya dị elu, yana opekata mpe 0.01 nke ngụkọta RNA. Maka otu nzọụkwụ RTPCR na-aga nke ọma, a na-ejikarị primers akọwapụtara mkpụrụ ndụ iji malite njikọ cDNA. A na-eme usoro ụzọ abụọ, ya bụ ntụgharị ntụgharị na nkwalite PCR na usoro abụọ. A na -ebu ụzọ atụgharị ntụgharị site na ndebiri RNA iji nweta cDNA, na cDNA enwetara na -ebute otu mmeghachi omume PCR ma ọ bụ karịa. Usoro ụzọ abụọ nwere ike iji oligo (dT) ma ọ bụ primers na-enweghị usoro iji duzie njikọ nke eriri mbụ nke cDNA, ma nwee ike tụgharịa tụgharịa ozi mRNA niile site na otu nlele.