Ngwa mwepụta TIANSeq mRNA

Ka ọ dị ugbu a, teknụzụ na-esite n'usoro dị elu na-adabere na teknụzụ usoro ọgbọ na-abịa. Ebe ọ bụ na ogologo ọgụgụ ọgụgụ nke teknụzụ usoro ọgbọ na -esote nwere oke, anyị ga -agbaji usoro ogologo zuru oke ka ọ bụrụ obere ọba akwụkwọ ibe ka ọ bụrụ usoro. Dị ka mkpa nke nnwale usoro dị iche iche si dị, anyị na-ahọrọkarị usoro nke nwere naanị otu ma ọ bụ nke mechiri emechi. Ugbu a, a na-ekesa iberibe DNA nke ọbá akwụkwọ na-esote usoro n'usoro n'ime 200-800 bp.

a) DNA adịghị mma nke ọma ma nwee ndị na -egbochi ya. Jiri nlele DNA dị elu iji zere igbochi ọrụ enzyme.

b) Ọnụ ego nlele DNA ezughi ezu mgbe ị na-eji ụzọ enweghị PCR arụ ụlọ ọba akwụkwọ DNA. Mgbe ntinye nke DNA ekewara ekewa karịrị 50 ng, enwere ike ịhọrọ usoro ọrụ PCR na-akwụghị ụgwọ n'oge a na-ewu ọbá akwụkwọ. Ọ bụrụ na ọnụ ọgụgụ nnomi nke ọbá akwụkwọ ahụ dị ala nke ukwuu ịhazi ya n'usoro, PCR nwere ike ịbawanye n'ọba akwụkwọ DNA mgbe njikọta ihe nkwụnye.

c) Mmetọ RNA na -eduga na nhazi DNA mbụ ezughị oke Mgbakasị RNA nwere ike ịdị na usoro nsacha nke DNA genomic, nke nwere ike ibute ọnụọgụ DNA ezughị oke na ntinye DNA ezughị ezu n'oge a na -ewu ọba akwụkwọ. Enwere ike wepu RNA site na iji RNase agwọ ya.

A-1

a) Mpekere pere mpe (60 bp-120 bp) na-egosi iberibe pere mpe na-abụkarị iberibe ihe nkwụnye ma ọ bụ dimers nke ndị nkwụnye guzobere. Iji mkpocha magnetik Agencourt AMPure XP nwere ike wepu iberibe ihe nkwụnye ọkụ a nke ọma wee hụ na ịdị mma nke usoro.

b) Mpekere buru ibu na -apụta n'ọ́bá akwụkwọ mgbe mmụba PCR gasịrị. Ọ bụrụ na iberibe DNA na -abawanye site na ihe karịrị bp 120 mgbe njikọta ihe nkwụnye ahụ, ọ nwere ike bute mmụba iberibe na -adịghị mma nke nkwalite PCR dị ukwuu. Mbelata ọnụọgụ nke PCR nwere ike igbochi ọnọdụ ahụ.

c) Oke iberibe iberibe DNA n'ọbá akwụkwọ mgbe njikọta ngwe ogologo Ogologo ihe nkwụnye dị na ngwa a bụ 60 bp. Mgbe ejikọtara akụkụ abụọ nke iberibe ahụ na ihe nkwụnye, ogologo ya ga -abawanye site na 120 bp. Mgbe ị na -eji ihe nkwụnye na -abụghị nke ngwa a nyere, biko kpọtụrụ onye na -ebubata ngwaahịa iji nye ozi dị mkpa dị ka ogologo nkwụnye. Biko hụ na ọrụ nnwale nnwale na arụ ọrụ na -eso usoro akọwara n'ime akwụkwọ ntuziaka a.

d) Mpekere DNA na -adịghị ahụkebe tupu njikọta ihe nkwụnye Ihe kpatara nsogbu a nwere ike bute site na mmeghachi omume na -adịghị mma n'oge nkewa DNA. Ekwesịrị iji oge mmeghachi omume dị iche iche maka ntinye DNA dị iche iche. Ọ bụrụ na ntinye DNA karịrị 10 ng, anyị na-akwado ka ịhọrọ oge mmeghachi omume nke 12 min dị ka mmalite mmalite maka njikarịcha, na nha nke iberibe ewepụtara n'oge a bụ ọkachasị na 300-500 bp. Ndị ọrụ nwere ike ịbawanye ma ọ bụ belata ogologo nke iberibe DNA maka nkeji 2-4 dị ka ihe ha chọrọ si dị iji bulie iberibe DNA ahụ nha nke achọrọ.

A-2

a) Achọpụtabeghị oge nkewa ma ọ bụrụ na DNA nke kewara ekewa pere mpe ma ọ bụ buru oke ibu, biko rụtụ aka na Ntuziaka maka Nhọrọ Oge Iberibe nke enyere na ntuziaka iji chọpụta oge mmeghachi omume, ma jiri oge a dị ka njikwa, tinyekwa sistemụ mmeghachi omume ka ịgbatị ma ọ bụ belata nkeji 3 iji mee mgbanwe ka mma na oge nkewa.

A-3

Nkesa nha DNA na -adịghị ahụkebe mgbe ọgwụgwọ nkewa

a) Usoro thawing na -ezighi ezi nke reagent nke irighiri ihe, ma ọ bụ agwakọtabeghị ya kpamkpam ka ọ gbasasịrị. Ghichaa reagent 5 -Fragmentation Enzyme Mix na ice. Ozugbo agbazere, gwakọta reagent ahụ nke ọma site n'iji nwayọ na -amị ala ọkpọ ahụ. Ejila ihe reagent eme ihe!

b) Ihe nlele DNA nwere EDTA ma ọ bụ mmetọ ndị ọzọ Mbelata ion nnu na ihe ndị na -emebi ihe na nchacha DNA dị ezigbo mkpa maka ihe ịga nke ọma nnwale ahụ. Ọ bụrụ na DNA etisasịwo na 1 × TE, jiri usoro enyere na ntuziaka a mee nkewa. Ọ bụrụ na ejighị ihe EDTA dị na azịza ya edoghị anya, a na -atụ aro ka ị sachapụ DNA ma gbasaa ya na mmiri deionized maka mmeghachi omume na -esote.

c) Nkọwa DNA nke izizi ezughị oke nha DNA nkewara ekewa nwere njikọ chiri anya na ọnụọgụ ntinye DNA. Tupu ọgwụgwọ nkewa, ịha nhata nke DNA site na iji Qubit, Picogreen na ụzọ ndị ọzọ dị mkpa iji chọpụta ọnụọgụ DNA na sistemụ mmeghachi omume.

 d) Nkwadebe nke usoro mmeghachi omume anaghị eso ntuziaka A ga -emerịrị usoro mmeghachiri ekewasịjasịrị na ice ka ntuziaka ahụ siri dị. Iji hụ na nsonaazụ kacha mma, ekwesịrị idobe akụkụ mmeghachi omume niile na akpụrụ akpụ ma kwadebe usoro mmeghachi omume mgbe emechara jụrụ oyi. Mgbe emechara nkwadebe ahụ, biko kpatụ ma ọ bụ pipet ka ọ gwakọta nke ọma. Adịla vortex!

1. Usoro agwakọta na -ezighi ezi (vortex, oscillation ime ihe ike, wdg) ga -ebute nkesa iberibe ọba akwụkwọ (dị ka egosiri na onyonyo na -eso), si otú a na -emetụta ogo ọbá akwụkwọ ahụ. Yabụ, mgbe ị na -akwadebe usoro mmeghachi omume nke Fragmentation Mix, biko jiri nwayọ pipette elu na ala ka agwakọta, ma ọ bụ jiri mkpịsị aka gị fegharị wee gwakọta nke ọma. Kpachara anya ka ị ghara ịgwakọta na vortex.

2. Ekwesịrị iji DNA dị oke ọcha maka owuwu ọba akwụkwọ

Ezigbo iguzosi ike n'ezi ihe nke DNA: Otu electrophoresis karịrị 30 kb, na -enweghị ọdụ

OD260/230:> 1.5

OD260/280: 1.7-1.9

3. Ọnụ ego ntinye DNA ga -abụrịrị eziokwu A na -atụ aro ka ejiri ụzọ Qubit na PicoGreen tụọ DNA, karịa Nanodrop.

4. A ga -ekpebi ọdịnaya nke EDTA na ngwọta DNA EDTA nwere nnukwu mmetụta na mmeghachi omume nkewa. Ọ bụrụ na ọdịnaya nke EDTA dị elu, ọ dị mkpa ka eme nsacha DNA tupu ule ọzọ.

5. A ga -akwadorịrị mmeghachi omume nke nkewa na ice Usoro nkewa ahụ na -enwe mmetụta maka ọnọdụ mmeghachi omume na oge (ọkachasị mgbe agbakwunyere nkwalite). Iji hụ na izi ezi nke oge mmeghachi omume, biko kwadebe sistemụ mmeghachi omume na ice.

6. Oge mmeghari nkewa ga -abụrịrị ihe ziri ezi Oge mmeghachi omume nke iberibe iberibe ahụ ga -emetụta oke ngwaahịa iberibe ahụ, si otu a na -emetụta oke nha nke iberibe DNA n'ọbaakwụkwọ.

1. Kedu ụdị nlele nke dabara na ngwa a?

Ụdị nlele nke ngwa a nwere ike ịbụ RNA zuru oke ma ọ bụ mRNA dị ọcha nwere ezigbo iguzosi ike n'ezi ihe RNA. Ọ bụrụ na ejiri RNA mkpokọta rụọ ọbá akwụkwọ ahụ, a na -atụ aro ka ị jiri ngwa mbibi rRNA (Cat#4992363/4992364/4992391) wepu rRNA mbụ.

2. Enwere ike iji nlele FFPE were ngwa a rụọ ọba akwụkwọ?

A ga -emebi mRNA dị n'omume FFPE ruo n'ókè ụfọdụ, yana enweghị ntụkwasị obi siri ike. Mgbe ị na -eji ngwa a maka owuwu ọbá akwụkwọ, a na -atụ aro ka ebuli oge nkewa (belata oge nkewa ma ọ bụ na ọ naghị eme nkewa).

3. N'iji usoro nhọpụta nha nke enyere na ntuziaka ngwaahịa, gịnị nwere ike ime ka akụkụ etinyere ka ọ yie ntakịrị mwepu?

A ga -eme nhọpụta nha n'ụzọ siri ike dabere na ọkwa nhọrọ nha na akwụkwọ ntuziaka ngwaahịa a. Ọ bụrụ na enwere ntụgharị, ihe kpatara ya nwere ike ịbụ na beads magnetik adịghị edozi oke okpomọkụ ụlọ ma ọ bụ agwakọtala ya nke ọma, pipette ezughị oke ma ọ bụ na mmiri ahụ na -anọ n'ọnụ. A na -atụ aro ka ị jiri ndụmọdụ nwere obere adsorption maka nnwale ahụ.

4. Nhọrọ nke ihe nkwụnye ọkụ na owuwu ọba akwụkwọ

Ngwa ihe owuwu ọbá akwụkwọ ahụ enweghị reagent nkwụnye, a na-atụ aro ka iji ngwa a yana TIANSeq Single-Index Adapter (Illumina) (4992641/4992642/4992378).

5. QC nke ọba akwụkwọ

Nchọpụta ọnụ ọgụgụ ọbaakwụkwọ: A na -eji Qubit na qPCR chọpụta mkpokọta mkpokọba na mkpokọta ntụpọ nke ọba akwụkwọ n'otu n'otu. Arụ ọrụ ahụ bụ nke kwekọrọ na ntuziaka ngwaahịa. Ntughari nke ọbá akwụkwọ ahụ ga -emezu ihe achọrọ nke usoro NGS. Nchọpụta oke nkesa ọba akwụkwọ: Iji Agilent 2100 Bioanalyzer iji chọpụta oke nkesa ọbá akwụkwọ.

6. Nhọrọ ọnụọgụ okirikiri nkwalite

Dika ntuziaka si kwuo, ọnụọgụ PCR bụ 6-12, ekwesịrị ịhọrọ ọnụọgụ PCR dị mkpa dabere na ntinye ntinye. N'ime ọba akwụkwọ dị elu, mmụba na-apụtakarị n'ọkwa dị iche iche, nke a na-egosipụta site na elu dịtụ ntakịrị mgbe elu nke ebumnuche elele na nchọpụta Agilent 2100 Bioanalyzer, ma ọ bụ mkpokọta achọpụtara nke Qubit dị ala karịa nke qPCR. Ịdị elu karịa nkwalite bụ ihe a na -ahụkarị, nke na -anaghị emetụta usoro ọba akwụkwọ na nyocha data sochirinụ.

7. Spikes na -egosi na profaịlụ nchọpụta nke Agilent 2100 Bioanalyzer

Ọdịdị nke spikes na nchọpụta Agilent 2100 Bioanalyzer bụ n'ihi enweghị nkewa nke nlele, ebe a ga -enwe iberibe karịa na nha ụfọdụ, nke a ga -apụtakwu nke ọma mgbe emechara PCR. N'okwu a, a na -atụ aro ka ị ghara ime nhọrọ nha, ya bụ ịtọ ọnọdụ nkewa ahụ ka ọ bụrụ 94 Celsius C maka nkeji iri 15, ebe nkesa nke pere mpe ma lekwasị anya, enwere ike ime ka ịdị n'otu dị mma.